Ученые из МГУ, Сколтеха и ИТЭБ РАН изучили механизм действия одного из ферментов, который разрезает ДНК, и предложили способ, позволяющий контролировать его активность. Эти разработки могут быть использованы для редактирования генома. Результаты исследования были опубликованы в журнале PLoS ONE.

Редактирование генома является одним из наиболее многообещающих направлений биотехнологии и молекулярной медицины будущего. Манипуляции с ДНК ученые осуществляют с помощью бактериальных ферментов. Эти ферменты узнают в последовательности ДНК определенный участок и в этом месте с хирургической точностью разрезают ДНК. В месте гидролиза может быть проведено включение, удаление или перемещение фрагментов ДНК. После внесения разрыва в ДНК клетка не погибает за счет естественной защитной системы — процесса репарации. При этом происходит исправление дефектного места за счет здоровой копии из парной хромосомы или же, в случае, если «правильной» копии гена нет, его можно внести в клетку вместе с ферментом-«редактором». Тогда для репарации поврежденной ДНК используется именно эта последовательность. Одна из самых востребованных технологий редактирования генома на сегодняшний момент — CRISPR/Cas. Однако у этого метода есть существенный недостаток — при использовании CRISPR/Cas возникает множество незапланированных и непредсказуемых мутаций. Одной из причин этих мутаций является то, что геномный редактор этой системы, белок Cas9 разрезает обе цепи в спирали ДНК, после чего запускается процесс негомологичной рекомбинации, при которой фрагменты ДНК могут перестраиваться случайным образом. Эти мутации не обязательно сразу приводят к каким-либо серьезным последствиям для клетки и организма, но чего ожидать от них впоследствии — не известно.

Для повышения точности редактирования генома в качестве потенциальных терапевтических агентов тестируются другие ферменты. Одними из них являются сайт-специфические никующие эндонуклеазы — ферменты, узнающие в ДНК короткую специфическую последовательность, но вносящие разрыв в строго определенном месте только в одну из цепей ДНК. При репарации одноцепочечных разрывов инициируется гомологичная рекомбинация, значительно уменьшающая количество возможных ошибок в ДНК.

Исследователи из Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН под руководством проф. Л.А. Железной изучают эти ферменты на протяжении двух последних десятилетий и являются одними из их первооткрывателей. Их коллеги из МГУ (химический факультет, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского) сконструировали модифицированные олигонуклеотиды с остатками азобензола и триэтиленгликоля, с помощью которых можно регулировать активность никующих эндонуклеаз.

Эта работа направлена на предотвращение появления неконтролируемых разрывов в ДНК. Химики создали модифицированный ДНК-дуплекс (короткий двухцепочечный фрагмент ДНК) с остатком триэтиленгликоля внутри цепи, содержащий участок, с которым никующая эндонуклеаза связывается, но не может его разрезать. Такой дуплекс блокирует активность фермента. Однако двухцепочечная структура дуплекса стабильна только при комнатной температуре. При нагревании до 45°С цепи ДНК расходятся, и никующая эндонуклеаза высвобождается из комплекса с негидролизуемым аналогом субстрата. Свободный фермент снова способен выполнять свою работу: он специфически разрезает модельную ДНК.

— Наши эксперименты подтвердили доказательство концепции подхода «обратимой молекулярной ловушки» в регуляции активности никующих эндонуклеаз модифицированными олигонуклеотидами. Температура переключения ингибитора ДНК-дуплекса может быть легко настроена путем изменения длины олигонуклеотида, поэтому наша система может быть адаптирована для различных применений, — рассказывает первый автор статьи, кандидат химических наук, научный сотрудник химического факультета МГУ Людмила Абросимова.

Авторы работы полагают, что предложенный ими подход будет способствовать разработке новых методов биоанализа и амплификации ДНК с вытеснением цепи, основанных на применении сайт-специфических никующих эндонуклеаз, а также расширит границы применения этих ферментов в редактировании генома.

Работа выполнялась при поддержке грантов РНФ (№ 14-24-00061) и РФФИ (№ 17-54-45126).