Новые молекулы сочетают две функциональные группы — бисфосонатная служит рецептором для катионов кальция, а нафталимидная интенсивно флуоресцирует после воздействия лазерным излучением. За счет этого они связываются с катионами кальция и могут их контрастно подсвечивать. Соединения перспективны для терапии костных заболеваний, а также неинвазивной диагностики различных новообразований, связанных с избыточной кальцификацией мягких тканей. Возможности новых молекул подтверждены серией экспериментов, в том числе и на клеточных культурах, а результаты работы опубликованы в июльском номере журнала Sensors and Actuators B.

Изображения с флуоресцентного микроскопа. Слева...

Изображения с флуоресцентного микроскопа. Слева и в центре: культура фибробластов человека, обработанная синтезированным соединением, зеленым подсвечиваются ионы кальция внутри клеток, черные области внутри зеленых образований — клеточные ядра. Справа: гидроксиапатит в водном растворе синтезированного соединения. Изображения предоставлены авторами работы

Бисфосфонатные группы в силу своей геометрии очень хорошо связываются с ионами кальция и поэтому обладают большими перспективами для неинвазивной диагностики в медицине и биологии. Например, повышенная концентрация кальция в тканях молочных желез, почек или сосудов может говорить о ранних стадиях различных патологий, в том числе злокачественных опухолей. В новой работе российские и немецкие химики совместили бисфосфонатные группы с флуоресцирующими метками на основе нафталимидов и так получили молекулы для поиска кальция.

«До нас на данной оптической платформе никто флуоресцентные бисфосфонаты не создавал», — рассказывает один из авторов работы, доцент РХТУ и сотрудник АО Научного центра «Малотоннажная химия», Максим Ощепков. «Мы совместили в одной молекуле хорошо известную алендроновую кислоту, применяемую для подавления разрушения костной ткани, и получили молекулу, которая идет туда, где наблюдаются проблемы с костной или мягкими тканями, селективно связывается именно с кальцием, а потом может быть детектирована по флуоресценции метки, возбужденной лазерным излучением. Получается такой рецептор, который соединяется с кальцием и подсвечивает его».

Химическая структура синтезированных веществ. И...

Химическая структура синтезированных веществ. Изображение предоставлено авторами работы

Препараты на основе бисфосфонатов используют для терапии костных заболеваний с 80-ых годов, однако прямых аналогов новой разработки в мире, по словам ученых не существует. Есть лабораторные исследования некоторых схожих соединений, но их синтез очень сложный и дорогостоящий. Он включает до десяти различных стадий и суммарный выход продукта получается настолько низким, что эти соединения вряд ли могут быть использованы на практике.

Российские и немецкие химики предложили блочный метод синтеза, который оказался гораздо более простым и включал максимум четыре стадии. С помощью него было получено три различных соединения, отличающихся длиной спейсера, разделяющего флуоресцирующую нафталимидную группу от рецепторной бисфосфонатной группы. Для всех соединений провели серию экспериментов: ученые изучали насколько стабильной будет их флуоресценция в широком диапазоне pH и условиях приближенных к физиологическим, а также оценивали интенсивность связывания новых молекул с ионами кальция.

Наконец, ученые проверили диагностические возможности новых соединений in vitro. Они вводили синтезированные вещества в культуру фибробластов человека и показали, что бисфосфонаты проникают через мембрану внутрь клеток, не повреждая их, и там связываются с ионами кальция, позволяя их потом визуализировать по флуоресценции. При этом внутрь клеточных ядер бисфосфонаты не проникают, что делает их малотоксичными. В другом эксперименте кроме фибробластов в смесь еще добавляли гидроксиапатит, основную минеральную составляющую костной ткани. Здесь бисфосфонаты уже преимущественно не проникали внутрь клеток, а соединялись с более доступным кальцием на поверхности гидроксиапатита, и так была показана модельная возможность контрастирования костной ткани на фоне мягких тканей.

Изображение с флуоресцентного микроскопа. Культ...

Изображение с флуоресцентного микроскопа. Культура фибробластов человека, обработанная синтезированным соединением, зеленым подсвечиваются ионы кальция внутри клеток, черные области внутри зеленых образований — клеточные ядра. Изображение предоставлено авторами исследования.

Флуоресцентная микроскопия обладает высокой чувствительностью и наглядностью, а флуоресцентные маркеры значительно безопасней и дешевле по сравнению с радиоактивными метками, и поэтому этот аналитический метод уже широко применяется не только в химии и биологии, но и в диагностической медицине. Новые соединения перспективны для отслеживания кальциевых процессов. Если ввести их перорально или с помощью инъекции, а потом облучить лазерным излучением, то возбужденная в нафталимидных группах флуоресценция контрастно подсветит кальциевые отложения в костных или мягких тканях различных полых органов. Более того, такой подход можно использовать даже при проведении операций: маска со светофильтрами позволяет хирургу видеть кальцинированные участки открытых тканей уже в непрерывном режиме. В ближайшее время исследователи планируют химически модифицировать новые вещества таким образом, чтобы они флуоресцировали не в видимом диапазоне, как сейчас, а в области ИК-излучения, которое гораздо лучше проникает через биологические ткани, что значительно повысит возможности диагностики.

Кроме медицинских аспектов новые соединения интересны и для фундаментальной науки. «Кальций очень важный с точки зрения биохимии катион», — рассказывает один из соавторов работы, доцент РХТУ и сотрудник АО НЦ «Малотоннажная химия», Сергей Ткаченко. «Его концентрация сильно отличается внутри и снаружи клеток многоклеточных организмов, и на этом завязано множество разных физиологических процессов, но кальций сложно детектируется другими методами, кроме флуоресценции, особенно если вы хотите отследить процесс в динамике и не разрушить ткани. Поэтому наша работа может быть использована другими научными группами как новый инструмент для изучения и визуализации кальциевых процессов, в частности физиологических». Сейчас ученые проводят переговоры с НИИ общей патологии и патофизиологии по совместным работам, посвященным визуализации кальция внутри клеток.

Исследование проведено сотрудниками кафедры химии и технологии биомедицинских препаратов РХТУ им. Д.И. Менделеева в коллаборации с АО НЦ «Малотоннажная химия», Институтом биологии гена РАН, Институтом общей физики РАН, а также Техническим университетом Кемница (Германия) и Университетом Эрлангена-Нюрнберга (Германия). Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (№ 19-79-10220) и программы «NitraMon» Европейского социального фонда (100339427).

Статья: A. Oshepkov et al, Naphthalimide-functionalized bisphosphonates for fluorescence detection of calcification in soft tissues // Sensors and Actuators B. — 2020. — V. 314. — DOI: 10.1016/j.snb.2020.128047